摘要

目的：早期非小细胞肺癌(NSCLC)复发率高，5年生存率低，尤其是淋巴结受累时。我们的目标是进行剂量递增研究，以评估术中近红外(NIR)荧光成像技术识别肿瘤第一个转移淋巴结(即非小细胞肺癌患者的前哨淋巴结)的安全性和可行性。

方法：对疑似I/II期NSCLC患者在肿瘤周围注射3.8-μg吲哚菁绿(ICG)评估A剂量递增1期临床试验的实时NIR成像，记录淋巴转移可视化、SLN识别和不良事件。

结果：38例患者接受开胸(n=18)或胸腔镜成像(n=20)行ICG注射和NIR成像。SLN的识别率随着ICG剂量的增加而增加，在μg或更低的剂量组中检测到的SLN不到25%，而在μg或更高的剂量组中检测到的SLN为89%。组织学检查发现在15例患者中识别出26颗NIRSLN，其中7颗淋巴结(6例患者)为转移灶。在组织学阴性的SLN患者中从未发现转移性淋巴结病变，也未发现不良反应。

结论：在这项初始剂量递增试验中，NIR引导下ICG识别SLN是安全可行的。ICG剂量大于μg可获得近90%的胸内SLN可视化，SLN有无转移与淋巴结清扫标本的最终淋巴结状态直接相关。需要进一步的研究来优化成像参数，并确认NSCLC中SLN定位的敏感性和特异性。

引言

区域淋巴结状态是早期非小细胞肺癌(NSCLC)最重要的预后指标。虽然使用计算机断层扫描(CT)和正电子发射断层扫描(PET)进行无创术前分期对于确定大于1cm的淋巴结转移非常有用，但这些方法经常遗漏区域淋巴转移。手术切除和淋巴结清扫仍然是标准术式，但是报道只有50%的患者行常规的完全淋巴结清扫。此外，由于NSCLC可以“跳过”到N2纵隔淋巴结，以及缺乏对多个采样淋巴结的深入组织学分析，淋巴结采样可能会错过继发于淋巴结转移的疾病。不幸的是，漏诊的转移性疾病患者常被认为是I期且未接受辅助治疗，这可能是导致近40%的复发率和50%-60%的5年生存率的原因。

与其他早期实体瘤相比，早期NSCLC复发率高，总体生存率差，提示患者分期被低估和/或治疗不足。不良的预后可能是由于淋巴结采样不足、跳跃性转移和/或组织学处理不充分而未识别隐匿性转移。前哨淋巴结(SLN)定位具有识别转移风险最高的淋巴结、对“高危”淋巴结进行深入的免疫组织化学分析以及通过局部淋巴结清扫降低发病率的优点，已成为乳腺癌和黑色素瘤的标准治疗手段。然而，SLN定位在NSCLC中一直是不可靠的，因为难以获得肺门结构的解剖学信息，而且信号发出率很低，使得示踪剂在无规结点或放射性结节的识别不理想。NIR成像已成功地用于皮肤癌、乳腺癌和胃肠道癌术中SLN的实时识别，并且由于其在NIR光谱(-nm)内的低吸收、低散射和低组织自发荧光，是在体术中成像的理想选择。因此，NIR荧光淋巴示踪器可以在不危及关键解剖结构的情况下进行外科解剖。此外，由于不需要激光和放射性，因此安全性更高。吲哚菁绿(ICG)是美国食品和药物管理局(FDA)批准的一种常见的血管内染料，也可用作NIR淋巴荧光团。因此，我们假设ICG的NIR淋巴成像可以帮助早期NSCLC患者识别SLN。本文报道了使用ICG通过开放式开胸影像平台或胸腔镜NIR系统评估NIR引导的SLN识别在早期NSCLC患者中的安全性和可行性的第一阶段临床研究的结果。

方法

标准

在年2月至年2月期间，共有46例因已知或疑似肺癌拟接受肺切除的患者在知情同意后参加了这项由DanaFarber癌症研究所机构审查委员会(Boston,Mass)批准的剂量递增SLN试验。排除标准包括18岁以下、怀孕、哺乳以及对碘、钡剂或ICG过敏。随后有8名患者因排除I/II期NSCLC、术前撤回同意或其他脏器手术(n=1)等后续数据而不符合条件。因此，38名患者接受了术中瘤周注射ICG，并接受了NIR介导的SLN定位。所有患者术前均行胸部CT和PET/CT扫描，肿瘤大于2cm、纵隔淋巴结肿大(1cm)、PET热结节或中央型肿瘤患者一般行颈部纵隔镜或支气管超声检查。在当前的研究中，所有患者都被要求PET/CT扫描结果阴性或先前颈部纵隔镜检查阴性才能加入，38名研究患者中有13名(34%)在本研究之前还通过纵隔镜或支气管内超声进行了额外的手术分期。

ICG制剂

ICG购买自Akorn，Inc.(IC-Green，Decatur，Ill)，或直接购自NovadaqTechnologies(BonitaSprings，FL)，置于10毫升无菌盐水中，得到3.2mM的原液，并在50毫升新鲜冰冻血浆(FFP)或25%人血清白蛋白(HSA；Baxter，Deerfield，Ill)中适当稀释，以产生ICG：FFP或ICG：HSA。最初的18名患者使用FFP作为ICG的偶联剂，直到其他器官系统的NIR成像显示与HSA的图像质量在技术上相等，此后使用HSA来避免接触FFP的潜在感染风险。

NIR荧光成像系统

实时NIR荧光图像是使用FLARE开放式手术成像系统或NovadaqTechnologies提供的10毫米胸腔镜NIR相机获得。每个系统都可以捕获白光和NIR荧光图像，并同时实时显示这些图像。视频输出包含手术视野的3幅图像：白光图像(即人眼看到的彩色视频)、纯NIR图像(黑白图像)和叠加在白光视频图像上的合并的NIR伪彩色(绿色)图像。这种方法避免了使用可见造影剂模糊手术视野，同时提供了将NIR图像与手术解剖结构相关联的能力。

术中NIR成像技术在可疑肺癌患者中的应用

胸腔内NIR成像的基本技术已经在前面描述过了，尽管低剂量ICG的成功受到限制。基于大型动物的临床前试验和这些早期研究，ICG的初始剂量为3.8μg，在剂量递增试验期间增加到μg。简而言之，在麻醉诱导和手术切口后，在NIR引导下，在可疑肺癌周围的4个部位，使用25号针将ICG：FFP或ICG：HSA制剂注入肺实质。肿瘤切除前，肺通气5分钟以促进ICG在通往SLN的淋巴通道内的迁移。当患者通过开胸手术或微创NIR胸腔镜进行手术切除时，尝试通过开放平台使用NIR成像显示淋巴通路和原位SLN。标记显示的SLN的位置，并由外科医生确定以标准的方式切除已知或可疑的肺癌。如果是良性的，无进一步外科手术并且将SLN留在原位，尽管标记了位置。如果肿瘤是恶性的，则将NIR识别的SLN切除，然后通过由外科医生确定的淋巴结清扫术，随后对淋巴结清扫术标本和手术区域进行成像，以确保识别并去除所有SLN。记录SLN的识别率、识别时间、识别的SLN数目、SLN站和病理。所有标本和手术部位的切除后图像都被存储起来，以供随后复查以确认NIR状态。将SLN固定在福尔马林中，石蜡包埋，进行标准苏木精-伊红(HE)分析。如果常规临床分析后有足够的组织可用，则对NIR识别的微小转移性疾病的SLN进行深入分析，包括以1.5mm的间隔对石蜡包埋的SLN进行横切，对SLN的浅、中、深部分进行HE分析，并对阶梯切片进行AE1/AE3细胞角蛋白、细胞角蛋白7和甲状腺转录因子1的免疫组织化学分析。微转移定义为0.2-2mm的肿瘤聚集物，如果这些聚集物小于0.2mm，则定义为孤立的肿瘤细胞或簇。

结果

患者特征

共有25名女性和13名男性患者总共38名疑似I/II期NSCLC患者，在手术切除时接受了肿瘤周围注射ICG，中位年龄64.9±10.3岁。虽然在所有5个解剖叶君可见肿瘤，但右上叶和左上叶肿瘤占优势。肺切除包括楔形、节段性切除、肺叶切除术或全肺切除术，由主治外科医生决定，大多数肿瘤通过肺叶切除术或节段性切除术切除。表1列出了每例患者的肿瘤位置、手术切除的范围和切除肺结节的病理。共有33名患者患有NSCLC，腺癌占所有切除肿瘤的80%以上，无论其肺叶起源。

表1NSCLC患者ICG剂量增加和术中前哨淋巴结成功定位

术中ICG剂量递增的NIR成像

38例患者使用ICG进行NIR成像，ICG剂量范围为3.8-μg。18例患者在开胸时使用开放式成像系统进行了术中NIR成像，20例患者使用微创胸腔镜进行了电视探查和术中NIR成像。当剂量小于μg时，20例患者中只有4例(20%)淋巴追踪和SLN识别阳性，因此表明淋巴转移和SLN识别不可靠。然而，在每个连续的、、和μg的队列中，淋巴转移和SLN识别率都有所提高，SLN识别率分别从33%增加到40%、80%和%(图1)。

图1前哨淋巴结（SLN）识别。SLN识别的剂量依赖性增加被证明是吲哚菁绿（ICG）剂量从3.8-μg的函数。在剂量最高组中，SLN识别率为％。RUL，右上叶；RML，右中叶；RLL，右下叶；LUL，左上叶；LLL，左下叶。

NIR引导下的SLN识别

在38名参与研究的患者中，5例不是NSCLC，因此没有进行SLN解剖或随后的淋巴结清扫。在33例可用于淋巴结分析的NSCLC患者中，术中共发现15例患者的26个前哨淋巴结(表1)。图2是术中淋巴转移的原位图像，显示绿色的SLN。从注射ICG到识别SLN，然后用NIR成像切除SLN的时间为3-min(在切除原发肿瘤以确定NSCLC诊断后才能切除SLN)，平均时间为30min。所有切除的SLN都进行了体外成像，以确认NIR阳性。图3是正常白光，纯NIR中SLN的离体图像，以及合并的伪彩色（白光NIR）图像，突出显示了SLN中NIR信号的外观和定位。

图2术中使用近红外（NIR）荧光成像实时识别前哨淋巴结（SLN）。A，吲哚菁绿的淋巴转移以绿色标记，从注射部位向肺门（箭头）方向发展。B，使用NIR荧光成像识别SLN，并显示为绿色（箭头）。

图3使用近红外（NIR）荧光成像的离体前哨淋巴结（SLN）成像。术中识别和切除SLN后，使用NIR成像对SLN进行离体成像以确认荧光。A，SLN的白光图像。B，纯净的NIR图像，显示白色的NIR荧光（箭头）。C，SLN中具有NIR荧光的SLN合并伪彩色图像，以绿色显示。

在NIR成像后，NSCLC患者接受了根治性淋巴结切除术或淋巴结采样，所有标本都进行了成像，以确定是否有另外的NIR阳性SLN，而本研究中没有发现任何其他NIR阳性SLN。在切除的手术标本中，每个患者平均采集了2.9±2个淋巴结站(即肺门，4站和7站)，这些淋巴结站独立于先前通过纵隔镜、支气管内超声或SLN成像采样获得的淋巴结站。此外，每个患者平均额外采集的结节数至少为6.5±5.3个，因为来自同一淋巴结站的多个淋巴结在最终的病理报告中通常不单独计算。

26个已识别NIR阳性SLN相对于原发肿瘤和注射部位的位置如图4所示。其中19个淋巴结位于肺门(n=14)或叶间(n=5)N1站。N2站7枚淋巴结中，2枚位于肺韧带(第9站)，1枚位于主肺动脉窗(第5站)，4枚位于上纵隔(第4站)。左上叶的SLN的位置上似乎特别不同。

图4通过近红外（NIR）成像引导识别的前哨淋巴结（SLN）站的淋巴图：在15例患者中共鉴定出26个NIR阳性SLN。证明了相对于原发肿瘤部位（和注射部位）所识别的SLN的位置。RUL，右上叶；LUL，左上叶；RML，右中叶；LLL，左下叶；RLL，右下叶；L，左；R，右。

NIR阳性SLN组织学分析

在15名患者的NIR引导下发现的26个淋巴结中，7个SLN(6名患者中)在随后的HE分析中显示出先前未知的转移性疾病的证据(表2)。所有7个组织学阳性的NIR阳性SLN均位于10或11淋巴结站内。虽然在外科淋巴结清扫标本内的其他淋巴结中发现了一些患者的转移疾病，但值得注意的是，这些淋巴结通常位于相同或更多的近端淋巴结站，因此意味着转移性疾病在SLN之外的淋巴扩散。在组织学阴性的NIR阳性SLN患者中从未发现转移性淋巴结病变。事实上，在6名患者中的2名患者，唯一的组织学阳性淋巴结，包括手术淋巴结切除标本中的淋巴结，是通过NIR成像确定的单个SLN。有趣的是，对标准HE认为阴性的7个NIR阳性SLN进行了深入的免疫组化分析，没有发现隐匿性转移性疾病的证据。

表2所有NIR阳性SLN患者的SLN与非SLN病理

讨论

前哨淋巴结活检在许多肿瘤恶性分期中是一个公认的预后指标和重要标准。然而，使用蓝色染料和放射性同位素的标准方法并不能成功识别NSCLC患者的SLN。Little及其同事在年首次尝试对肺癌进行SLN活检，但成功率只有47%。年，Liptay及其同事成功地在87%的肺癌患者中使用了锝元素(Tc)识别SLN；然而，这些结果在2期多中心CALGB试验中无法重现，该试验仅在51％的患者中识别出SLN。尝试过各种技术，但结果不可靠，敏感性和/或特异性较差。次优结果被归因于胸腔内的无结节、“光透”效应(注射部位的高放射性信号由于附近组织中背景信号的增加而产生假阳性结果)，以及蓝色染料对关键解剖结构的扭曲。

与目前的SLN定位技术相比，NIR成像具有独特的优势，已被证明对多种癌症有效，包括乳腺癌、宫颈癌、胃肠道癌和皮肤癌。本研究证实，NIR成像可以在肺部手术中实时进行，以显示淋巴结，而不会像蓝色染料那样扭曲胸腔关键的解剖结构，也不会产生与放射性同位素相关的辐射风险。虽然只有一项机构概念验证研究，但在μgICG剂量组内，至少发现1例SLN。虽然这项早期剂量递增试验不能确定NIR成像在NSCLC患者分期中的作用，但我们已经确定了SLN识别的剂量反应，并证明了在早期NSCLC患者中进行微创NIR引导的SLN识别的安全性和可行性。此外，虽然这项试验的主要目的是确立安全性和剂量-反应关系，但我们已经表明，SLN的识别可以导致淋巴转移性疾病的检测，并可以通过免疫组织化学或其他方式增加组织学分析以改善NSCLC分期。

尽管乳腺癌和黑色素瘤患者胸腔内SLN显像所需的ICG剂量高于临床SLN显像所需的ICG剂量，但这项研究报告的成功剂量明显低于心输出量测量或其他肺成像的剂量。令人惊讶的是，尽管成功地将ICG连续翻倍在猪中用于肺SLN定位的最大剂量（即10mg），在这些低剂量的人中未鉴定出SLN。在NIR技术应用于人类乳腺癌患者中，类似的发现导致了新的剂量增加方案，起始剂量为μg，这表明虽然人类和大型动物模型的大小相似，但不同物种和器官系统的淋巴图谱可能存在根本差异。自年开始试验以来，我们的ICG剂量已从3.8μg大幅增加到μg。目前μg的剂量高于黑色素瘤和乳腺癌患者NIR成像中使用的μg，但远低于之前日本研究报告的5-10mg剂量。考虑到报道使用大剂量ICG会导致的过敏反应和视觉解剖结构变形的风险(尽管很少见)，因此我们的目标是确定一种安全、最佳的注射剂量，既不改变手术视力，又能识别肺癌患者的淋巴转移。我们已经证明了在到μg的剂量下SLN的剂量依赖性成功识别。虽然样本量很小，但在μg剂量组内的所有患者中检测到SLN表明，尽管转移性疾病可以到达对侧淋巴结盆地，但第一个引流淋巴结(即SLN)在这些对侧淋巴结中的定位可能很少见。考虑到手术淋巴结清扫标本中没有任何剂量的NIR淋巴结，在μg的剂量下，20%的患者不能识别出SLN，这不太可能是纵隔其他部位存在SLN的结果，但肯定是ICG剂量不足或继发于实质内注射部位ICG渗漏的结果。我们正在研究改进我们的技术以最大限度地检测SLN的方法。

虽然淋巴结定位可能会受到大部分转移性淋巴结病变的影响，但本研究中的患者被特别选择为临床上没有淋巴结病变的证据，如PET/CT和/或颈纵隔镜检查结果阴性所证明的那样。尽管如此，由于肿瘤大小与转移性淋巴结病变的发病率相关，在高剂量和低剂量的ICG研究中都包括了各种大小和大叶位置的肿瘤。与以前发表的乳腺癌患者SLN活检标本的数据相似，目前的研究结果没有证明SLN的阳性识别与肿瘤大小或位置之间存在相关性。相反，在这项研究中，ICG剂量是决定SLN识别可能性的主要因素。然而，很明显，从肺肿瘤到SLN的淋巴引流模式有显著的差异。尽管确定的26个NIR阳性SLN中近四分之三位于附近的N1站，但令人惊讶的是，27%的患者SLN已经“跳过”到N2站，这使他们面临着患有隐匿性III期疾病的风险，尽管术前对临床I期疾病进行了评估。这与其他使用锝99的人报告的跳跃转移的20%-30%的发生率是一致的，并证明了在这些患者中准确识别SLN的重要性。

在叶内位置(11站)仅识别出3个SLN，在较远的下叶和节段位置未发现SLN。我们假设这是注射部位和周围肺实质高荧光的结果，这可能掩盖了在实质内淋巴结站(节段性和亚节段性)内识别高于背景的离散独立NIR信号的能力，导致相当于“光亮效应”。我们通过将注射部位定位在视野之外，同时观察肺门和纵隔减少这一影响，但这可能仍在影响我们对更靠近肿瘤本身的淋巴结成像的能力。其次，如果ICG从注射部位泄漏到附近的肺部，成像就特别困难，这可能使我们无法识别这些淋巴结站中离散淋巴结的能力，并建议从切除的标本中分离出节段性结节的单独成像可能已经在这些部位发现了额外的SLN。第三，尽管NIR成像在深度可达1cm的情况下是可行的，但在充气肺或支气管结构周围的纵隔内似乎并非如此。尽管如此，最终病理仍未发现更远端节段位置的转移性淋巴结，即使在10或11站淋巴结发现转移性SLN的患者中也是如此，这表明已识别的NIR阳性SLN足以识别转移性淋巴结病变。

纵隔(N2)SLN的高发病率和SLN在不同患者之间的位置差异突出了预测NSCLC患者转移淋巴结病变部位的难度。在本试验中，尽管术前PET检查和纵隔镜检查都是阴性的，但有7个淋巴结在HE染色中呈转移性疾病阳性。因此，尽管我们的样本量很少，但SLN分析导致在本研究中发现SLN的15名NSCLC患者中有6名被提升了分期。这表明40%的患者术前被低估了，与CALGB中的I期NSCLC患者中27.5％的患者没有显着差异，尽管术前检查结果为阴性，但在手术切除时仍患有淋巴结阳性。

识别NSCLC患者的SLN可以通过免疫组织化学或聚合酶链反应进行详细的组织学分析，从而在NSCLC进行更准确的分期。虽然本研究中发现的少数HE阴性SLN的免疫组织化学评估尚未发现隐匿性转移，但我们预计在更大的人群中进行其他分析，包括聚合酶链反应，将有可能在这些HE阴性的SLN的子集中发现微转移疾病。这可能导致确定哪些患者可能受益于先前未发现的隐匿性疾病的辅助治疗，目的是提高存活率。我们目前的1期临床试验已经确定了用语识别SLN的ICG剂量反应，并证明了NIR成像用于NSCLC手术中微创切除的SLN识别的安全性和可行性。尽管我们已经证实了NIR阳性SLN内转移疾病的检测，但还需要更多的研究来改善SLN成像和剂量传递，确定这种方法的敏感性和特异性，并最终评估SLN分析对早期NSCLC患者辅助治疗和总体结果的影响。

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